01 什么是彗星试验？
当各种诱因引起细胞DNA链断裂时，细胞裂解液可以使细胞内除核DNA外的物质扩散至电解液，留在原位的DNA在碱性电解质条件下解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放，电泳时带负电荷的DNA向正极迁移形成"彗星"状图像，未受损伤的DNA保持球形。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度。
02 什么情况下需要做彗星试验？
1) 新药申报
新药申报时，对药物遗传毒性研究所采用的标准试验组合二：一项细菌回复突变试验，一项啮齿类动物造血细胞微核试验和第二项体内试验（彗星试验、转基因小鼠体内突变试验、DNA 共价结合试验）。
2) 新化学物质申报
新化学物质申报时，当所提交的三项体外致突变存在阳性结果时，根据不同的遗传终点，选择对应或不同遗传终点的体内致突变试验，如彗星试验、UDS试验等。
3) 农药申报、化妆品原料申报
如农药申报、化妆品原料申报过程中，可能进行的体内遗传检测，以及其他需要进行彗星试验的情况。
03 如何做彗星试验？
目前常采用的试验类型为哺乳动物体内碱性彗星试验，在没有特定靶器官的条件下，主要通过动物肝脏评估被测物DNA损伤能力，参考的指导原则主要为OECD TG489，或不同的国标进行检测，如GB 31655-2021等。
对于哺乳动物体内碱性彗星试验，通常会设溶媒对照组、阳性对照组及3个受试物组。50只SD大鼠，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。对于短期给药受试物一般最高限值为2000 mg/kg，对于给药14天或更长时间的试验，如果能耐受，限度剂量为1000 mg/kg。阳性对照物一般选择甲基磺酸乙酯（EMS），染毒剂量为200 mg/kg。各组动物分别在 0 h、24 h、45 h经口灌胃染毒。所有动物在末次染毒后3小时内进行安乐死，取肝脏中叶细胞制作玻片，经裂解、解旋、电泳后，染色观察。
目前市场上已有成品化的彗星试验试剂盒，国产品牌如汇智和源生物技术（苏州）有限公司生产的彗星试剂盒等，进口品牌如Trevigen的Comet Assay Kit等，试剂盒基本包含了试验除染色液外的基础试剂和玻片，整体试验流程制定基本符合OECD要求，能帮助试验更加快速和顺利的完成。
04 如何分析彗星试验的结果？
使用彗星分析软件进行分析，每只动物观察并分析150个细胞（不含刺猬细胞）的尾DNA含量百分率（尾DNA%），尾长以及尾矩，并使用个体动物的中位值计算组间平均值。分析组间尾DNA%差异，判定受试物引起的DNA断裂程度。判定标准可参考OECD TG489的要求。
05 注意事项和常见问题
1) 阳性对照物的选择
根据OECD和国标相关系列标准，推荐阳性对照物如下：
|
化学物及CAS.号 |
靶器官 |
|
甲磺酸乙酯 EMS (CAS 62-50-0) |
所有组织 |
|
乙基亚硝基脲 (CAS 759-73-9) |
肝、胃、十二指肠、空肠 |
|
甲磺酸甲酯 MMS (CAS 66-27-3) |
肝、胃、十二指肠、空肠、肺及支气管肺泡细胞 肾、膀胱、睾丸、骨髓造血系统 |
|
N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍 (CAS 70-25-7) |
胃、十二指肠、空肠 |
|
二甲基肼吡啶 (CAS 306-37-6) |
肝、肠 |
|
甲基亚硝基脲 (CAS 684-93-5) |
肝、骨髓、血细胞、肾、胃、空肠、脑 |
2) 背景数据
建议每个实验室在开展彗星试验之前，建立自己的背景数据库，包括阴性和阳性对照数据。在JaCVAM所进行的国际验证报告中，不同实验室所得到的彗星试验结果不尽一致，如阴性对照结果尾DNA%范围在0-8.6之间，因此在有一定的背景数据之上，才能对所得到的实验数据进行更好的判断，减少假阳性或假阴性的判定概率。
3) 操作过程
单细胞悬液：制备铺胶用的单细胞悬液时，细胞数量建议在1×105～4×105个/mL，或根据实验室经验自行调整，过多的细胞在后期镜下观察时会产生细胞的重叠，导致无法分析，数量过少则可供分析数量可能不足。特别需要注意的是，阳性对照组的单细胞悬液数量在使用时，需要再进一步的稀释，防止重叠现象。
脱胶问题：脱胶属于彗星试验过程中常见的问题，在裂解、电泳过程中都可能发生，主要从以下几个方面预防，首先，电泳胶在使用前，一定要确保充分的熔化，使用过程中的保持温度可稍高一些，比如40℃，防止因降温过快导致固化；其次在铺胶过程中，尽量快速准确，保证涂胶均匀，在使用试剂盒提供的带孔玻片时，可对玻片预热，铺胶时保证胶液边缘能与孔的边缘充分接触，从而依靠表面张力将胶面固定；最后，在裂解和电泳过程中，尽量不要直接触碰胶面，不要将液体直接倾倒至胶面处，以免将胶面冲脱。
染色问题：染色液可根据各个实验室配备的荧光显微镜来选择，常见的有SYBR Gold、SYBR Green I、Gelred、GeneRed、碘化丙啶或溴化乙锭等，值得注意的是，染色完毕后，可尝试再用PBS或超纯水清洗一次玻片，防止染色过度导致背景着色过重，这个步骤可以在实验室建立背景数据中的模拟试验中尝试。
06 结果展示
汇智泰康在CNAS-GLP体系下，根据OECD指导原则进行了十余项彗星试验的检验检测，列举了部分检测结果如下：
|
受试物/剂量 |
组别/性别 |
动物编号 |
尾DNA% |
|
|
个体动物（n=150细胞） |
平均值±SD （n=5/性别/组） |
|||
|
超纯水，0 mg/kg体重 |
1/M |
1 |
4.35 |
3.73±1.84 |
|
2 |
3.05 |
|||
|
3 |
4.59 |
|||
|
4 |
0.91 |
|||
|
5 |
5.73 |
|||
|
EMS，200 mg/kg体重 |
2/M |
6 |
31.81 |
31.83±6.14** |
|
7 |
35.95 |
|||
|
8 |
33.84 |
|||
|
9 |
36.25 |
|||
|
10 |
21.32 |
|||
|
xxx，500 mg/kg体重 |
3/M |
11 |
3.47 |
5.96±2.18 |
|
12 |
5.84 |
|||
|
13 |
8.35 |
|||
|
14 |
4.20 |
|||
|
15 |
7.94 |
|||
|
xxx，1000 mg/kg体重 |
4/M |
16 |
1.86 |
1.44±0.75 |
|
17 |
2.13 |
|||
|
18 |
1.28 |
|||
|
19 |
0.21 |
|||
|
20 |
1.72 |
|||
|
xxx，2000 mg/kg体重 |
5/M |
21 |
4.23 |
7.22±3.47 |
|
22 |
7.89 |
|||
|
23 |
12.94 |
|||
|
24 |
5.83 |
|||
|
25 |
5.22 |
|||
附图
正常细胞（无明显拖尾） 倍数：20x
细胞拖尾（彗星）倍数：20x
刺猬细胞 倍数：20x
|
1/M TS |
1/F TS |
|
|
|
备注：HE染色，10X，肝脏，未见异常改变
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