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【文献】体外代谢在新药早期评价中的应用与发展

2020-11-17发表
外代谢在新药早期评价中的应用与发展
Application and development of in vitro metabolism study at early drug discovery stage

作者

吴 慧, 彭 英, 孙建国张雪媛, 仲云熙, 王广基
中国药科大学药物代谢动力学重点实验室

摘要
药物代谢研究与新药研发中的诸多环节密不可分, 包括候选化合物的设计与先导化合物的筛选等。

药物代谢研究一般分为体内代谢研究与体外代谢研究。

与体内代谢研究相比, 体外代谢研究可直接观察候选化合物与受试靶点的选择性作用, 不需要消耗大量的样品和实验动物, 操作快速简便, 适用于代谢信息不明确的候选化合物进行高通量筛选。

目前, 体外代谢研究已被广泛应用于新药的早期代谢评价中, 主要涉及代谢稳定性、代谢酶亚型鉴定以及代谢性相互作用等。

本文就体外代谢研究在上述三方面的具体应用进行归纳总结, 为中国创新药物实施“早期评价、早期淘汰”的研究策略提供参考。

正文
新药开发是一项耗资大、周期长、风险高的系统工程。

十余年来, 新化学实体 (NCEs) 转化成临床有效新药的速率不断下降, 一般来说, 上市一种新药的研发周期约为10~15 年, 耗资约3.5~5 亿美金,淘汰率在1/5 000 左右。

其中, 由安全性问题与药代动力学性质不良引起NCEs 成药失败的比例高达60%,且这一比例还在逐年升高。
2011年, 陈凯先院士在中国药学大会上对中国创新药物开发提出了“早期评价、早期淘汰”的研发策略。

新药开发过程通常包括临床前研究、临床试验、报批和生产上市4 个阶段。

药物代谢研究在新药开发的前两个阶段具有重要的指导意义, 尤其是在代谢信息不明确的开发早期。

通过利用各种体外代谢模型对候选化合物的代谢特性 (如代谢稳定性、代谢多态性、活性/毒性代谢产物生成、参与代谢的药物代谢酶种类以及代谢相互作用等) 进行高通量筛选, 可以对代谢过快或生成毒性代谢物的候选化合物进行结构改良, 或通过合成活性代谢物或模拟活性代谢物的结构得到新的候选化合物。

与体内代谢研究相比,体外代谢研究可在新药研发早期利用候选化合物的体外代谢参数合理预测候选化合物的体内药动学行为, 指导后期药效、药动以及安全性评价的模型选择,缩小体内研究的筛选范围。

近年来, 随着高分辨分析技术与分子生物学技术的发展, 以肝脏为基础的一系列体外代谢研究模型被广泛应用于新药研发的早期评价中。

本文就体外代谢研究在3 种早期评价策略 (代谢稳定性、代谢酶亚型鉴定、代谢相互作用) 中的具体应用与改进、取得的经验与成果以及目前存在的问题与争论作阐述,为建立符合中国国情的早期代谢评价模式提供参考。


1体外孵育系统

药物体外代谢研究与体内代谢研究相比, 可排除体内诸多干扰因素而直接观察药物代谢酶对底物的选择性代谢, 适用于体内代谢转化率低及缺乏灵敏检测手段的药物, 且省时省力、稳定高效, 尤适于大量化合物的高通量筛选。

目前,研究药物代谢的体外模型主要有亚细胞系模型(如微粒体、Cytosol、S9)、细胞系模型(如原代肝细胞、转基因细胞系、干细胞诱导分化的肝细胞)、重组酶系模型、组织切片模型及离体动物模型(如肝/肠灌流模型) 等,各模型在系统结构与代谢机制等方面各具特点 (表1)。
表1.jpeg

在长期的实践中, 研究人员除根据自身的研究背景、目的及条件选择恰当的体外模型进行代谢研究外,还对体外实验中的各成分 (如金属离子、孔道蛋白、有机溶剂、不饱和脂肪酸等) 和组成比例不断优化与改进, 以期对药物代谢情况做出合理准确的预测。

1.金属离子

1992 年, Yang发现生物系统中的二价金属离子 (如Mg2+) 可通过改变膜脂的物理状态间接影响膜结合蛋白 (如CYPs、UGTs 等) 的活性,而Fisher 等证实在体外人肝微粒体孵育系统中引入Mg2+可将UGTs 的反应速率提高4~7 倍。

因此MgCL2是体外孵育体系中的常见组分, 其常用浓度为5mmol·L−1或10mmol·L−1 。

2.孔道蛋白

葡糖醛酸转移酶 (UGTs) 是最重要的II 相代谢酶之一, 它与CYPs 均为膜结合蛋白, 共存于内质网膜上。

UGTs 的活性部位朝向内质网腔,导致体外孵育时UGTs 的活性表现需要溶解微粒体膜 (如Tritonx-100) 或者孔道蛋白 (如丙甲菌素) 的参与。

其中, Tritonx-100 等去污剂因多为非离子表面活性剂而对多种检测手段存在信号干扰, 故目前在微粒体孵育系统中通常使用丙甲菌素来提UGTs的活性。

丙甲菌素是一种膜活性肽, 能自发插入到脂双层中并相互聚集形成通道结构。

Fisher 等考察了微粒体孵育系统中丙甲菌素的浓度与膜结合蛋白酶的潜伏活性之间的关系, 发现丙甲菌素最佳浓度50μg·mg−1pro 时II 相结合反应速率提高了2~3 倍,但Walsky 等的最新报道中却认为在蛋白浓度较低时, 丙甲菌素浓度400 μg·mg−1pro 更为合适。

另有研究发现, 丙甲菌素对UGTs 的影响具有性别差异与种属差异。

Mazur以双酚A 在大鼠与人肝/肠微粒体中的葡糖醛酸结合反应为例, 对照组中双酚A 在雌鼠微粒体中Km 值远高于雄鼠, 在人肠微粒体中的Vmax略低于大鼠; 当丙甲菌素存在时, 双酚A 在大鼠微粒体中Km 值显著提高, 且雄鼠的增长幅度较雌鼠更大, 逆转了对照组中的雌雄差异, 同时双酚A 在大鼠和人肠微粒体中的Vmax也显著提高, 但大鼠的增长幅度较大 (约为人的30 倍)。

3.有机溶剂

研究表明, 常用有机溶剂 (甲醇、乙腈、DMSO、乙醇及异丙醇等) 均可影响多种CYPs同工酶介导的代谢反应, 其中DMSO 是公认的对代谢酶活性抑制最强的有机溶剂。

Li与Nirogi等分别报道极低含量的DMSO (0.1%) 即可使CYP1A2介导的非那西丁脱乙基代谢与CYP2E1 介导的氯唑沙宗6 位羟化代谢的反应量分别降至对照组的70% 与40%。

Vuppugalla 等发现CYP2B6 介导的安非他酮羟化代谢的动力学参数Km与体系中乙腈、DMSO、乙醇等有机溶剂呈浓度依赖性增大, 而CYP2C8 介导的紫杉醇羟化代谢的动力学参数Km仅与DMSO、乙醇呈浓度依赖性增大; 虽然甲醇对前者基本无影响,但对后者却存在低浓度降低其Km值、高浓度 (≥2%)增大其Km值的现象。

甲醇的这种双重效应在González-Pérez等的研究中再度被证实, 低浓度甲醇或乙腈(0~2%) 可降低CYP2C9 介导的 (S)-华法林羟化代谢的Km值, 而高浓度甲醇 (≥2%) 则增大其Km值;但含量2% 以下的乙腈、甲醇、乙醇对CYP3A4 介导的咪达唑仑1'-羟化代谢无显著影响。

因此Li 等建议在体外孵育系统中有机溶剂的含量应控制在1%及以下; 同时Kim等提出根据每个CYPs 亚型受每种有机溶剂影响程度的不同, 在高通量筛选中对混合探针底物进行合理的组合搭配以获得最佳孵育条件。

4.不饱和脂肪酸

近年来, 牛血清白蛋白 (BSA)效应在校正体外酶动力学参数方面的研究成为热门。

大量文献报道证实, 用BSA 矫正后的体外表观Km值进行体外−体内相关性分析所得到的体内肝清除率更接近于药物实测值 (2~5 倍)。

Rowland 等发现生物膜在体外孵育 (37 ℃) 过程中会释放一些抑制CYPs与UGTs活性的长链不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、花生四烯酸等), 而BSA 的加入可以封闭这些不饱和脂肪酸在孵育过程中自生物膜的脱落, 逆转Km值的升高, 称为“BSA 效应”。

如在BSA 存在下, 苯妥英羟化代谢的Kmu(unbound Km)显著降低 (约为对照组的5%) 而Vmax不变; 但后续研究发现, 高浓度BSA (~4%) 会使苯妥英的游离药物分数显著降低, 导致苯妥英羟化代谢的表观Km在BSA 存在下的变化不明确。

因此, BSA 亦是一把“双刃剑”, 其净效应取决于受试化合物与代谢酶的亲和力、代谢酶对受试化合物的代谢能力及受试化合物自身的蛋白结合率。

目前在体外孵育液中BSA的浓度通常控制在2% (w/v) 及以下, 常用浓度为0.5%、1%、2%。

过去认为BSA 在矫正酶动力学参数时一般仅降低Km值而不影响Vmax值, 但2011 年Manevski 等研究发现, 当选用专一性更强的探针底物恩他卡朋与齐多夫定代替常用的4-甲基伞形酮与丙泊酚来考察UGT1A9 与UGT2B7 时, BSA 降低两者的Km值,同时大幅提高UGT1A9 的Vmax值而不影响UGT2B7的Vmax值。

Manevski 在文中呼吁研究“BSA 效应”时应注意探针底物选择的多样性与合理性, 外推实验结果时需谨慎。

此外, 由于不饱和脂肪酸的抑制效应存在酶选择性, 故“BSA 效应”也存在酶选择性,如BSA 可降低UGT1A9 的Km值而对UGT1A1 与UGT1A6 无影响。

不仅是UGTs, 在本实验室开展的代谢研究中发现CYPs 也存在“BSA 效应”的底物选择性和酶选择性。

迄今为止, 确证存在“BSA 效应”的代谢酶主要有UGT1A9、UGT2B4、UGT2B7, 以及近几年刚被发现并纳入的CYPs同工酶 (CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9等)。

2体外代谢稳定性与体内外推

对候选化合物代谢稳定性的评估是早期药物研发的关键。

代谢稳定性差意味着化合物在体内较容易被代谢, 往往导致不良的药代动力学性质, 如体内生物利用度低、作用时间短等。

因此, 研究人员通常结合药效活性, 筛选出t1/2适宜、清除率低的化合物进行后续实验。

目前, 人肝微粒体已普遍应用于早期代谢稳定性的高通量筛选, 而人原代肝细胞或冷冻肝细胞主要应用于先导化合物的体外−体内参数外推(IVIVE)。

2009 年, Chao 等提出一种微流控细胞培养仿真系统, 它将生物芯片上载有不同细胞系的各个元件通过微流技术彼此关联形成一个信息网络,以模拟受试化合物在多个组织器官中的代谢清除。

在新药设计阶段, 由于代谢信息缺乏或不明确,通常采用底物消除法。选择较低浓度的酶蛋白 (≤ 1mg·mL−1) 与候选化合物 (≤ 10μmol·L−1)进行体外孵育, 以0 min 孵育液中的原药量 [S]0 作为100%,参照求算x min 孵育液中剩余原药 [S] 的相对百分数(R, %)。

其中, 在新药设计初期, 为满足大量候选化合物的高通量筛选, 通常固定一个反应时间 (如30 min),用此单点R值 (%) 区分快代谢化合物与慢代谢化合物, 以寻找目标化合物群。

随后, 在新药设计中期,针对目标化合物群, 选取5 或6 个孵育时间点 (一般在0~60 min 之间取点)的R值 (%) 对孵育时间作底物衰减的曲线图 (公式1) 或半对数图 (公式2), 根据公式3 换算, 或用SigmaPlot、WinNonlin、DeltaGraph等软件进行最小二乘法非线性拟合, 均可得到目标化合物群的体外消除速率常数 (ke) 与消除半衰期(t1/2, in vitro), 根据生理参数可进一步预测其体内清除率, 以寻找先导化合物群。

若此实验中同时考察多个底物浓度, 则可得到每个底物浓度水平下的ke值, 将其对底物浓度作曲线图 (公式4) 或倒数图 (公式5),通过软件拟合即可获得先导化合物群的酶动力学参数Km和Vmax值, 根据公式6 可得出代谢酶系统对NCEs 的内在固有清除率 (CLint, in vitro)。

辉瑞公司的Zhao 等提出了更为快捷的双点法与等比混合法, 通过公式7 可将获得的t1/2, in vitro直接转化为CLint, in vitro。

[S] = [S]0·e−ke·t(1)

lnR = −ke·t (令R = [S]/[S]0) (2)

t1/2= −ln(0.5)/ke= 0.693/ke(3)

ke= ke([S]→0)·(1−[S]/([S]+Km))

= Vmax/Km*(1−[S]/([S]+Km)) (4)

1/ke= 1/Vmax·[S]+Km/Vmax(5)

CLint, in vitro= Vmax/Km (6)

CLint, in vitro= 0.693/t1/2(7)

运用Houston和Carlile 等提出的比放策略,选择合适的肝脏生理模型 (静脉均衡模型、并联小管模型、分布和分散模型等), 通过生理转化因子可从体外CLint推导体内肝清除率 (CLh), 结合非肝消除途径即可得出总清除率。

2011 年, Zhu 等指出当受试化合物的固有清除率较低时, 3 种肝脏生理模型的体内预测结果相差不大; 但当固有清除率较高时(肝提取率 > 0.7), 3 种模型给出的肝清除率预测值差异较大; 相比而言, 运用较复杂的散射模型预测准确性较好。

然而, 在许多报道的回顾性研究中发现应用人肝微粒体进行IVIVE 总倾向于低估CL 值。

近年来, 为了提高IVIVE 的准确性, 研究人员针对预测的各个环节开展了大量研究, 包括血浆游离药物分数的校正以及在此基础上增加的微粒体温孵体系中游离药物分数的矫正, 应用人肝细胞替代人肝微粒体以弥补微粒体中缺失酶系对NCEs 的代谢清除, 选用经验因子或回归因子替代生理因子进行放大预测等。

虽然在一定程度上提高了IVIVE的可靠性, 但低估现象依然存在且机制不明。

一些研究人员认为在正常机体内环境中, 化合物经肝门静脉进入肝脏后, 须进入肝细胞才能发生代谢清除, 而绝大多数化合物以主动转运的方式进入肝细胞, 所以应将转运体的考察纳入IVIVE 对CL 的预测中。

不过目前尚未有足够的信息确证肝细胞的主动吸收机制对肝脏固有清除率的贡献。

3代谢酶亚型鉴定

在新药开发早期进行代谢酶亚型鉴定对预测潜在药物相互作用具有重要意义。

药物在体内的生物转化主要分为Ⅰ相代谢与Ⅱ相代谢, 其中CYPs 介导了大多数药物 (约75%) 的代谢, 在药物代谢中占据了非常重要的地位, UGTs 次之。

此外, 参与药物代谢的Ⅰ相反应酶系还包括黄素单氧化酶 (FMO)、单胺氧化酶 (MAO)、酯酶、黄嘌呤氧化酶、醇脱氢酶和醛脱氢酶等, Ⅱ相反应酶系还包括磺基转移酶 (SULT)和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 等。

代谢酶亚型鉴定的体外方法包括特异性化学抑制剂、单克隆抗体、基因重组酶、亚细胞成分 (需与化学抑制剂或单克隆抗体联合) 以及相关性分析等。

其中化学抑制剂的普适性最强但专一性差。如尼氟酸低浓度时是UGT1A9 的选择性抑制剂, 而高浓度 (≥50 μmol·L−1) 时对其他UGTs 同工酶也有抑制作用, 尤其是UGT1A1。

相比而言, 机制性抑制剂的作用专一性优于可逆抑制剂, 如CYP3A4 的机制性抑制剂CYP3cide可区分CYP3A4 和CYP3A5 这两种亚型。

单克隆抗体被认为是目前最有效的代谢酶亚型鉴定方法, 其优势在于高效、特异性强, 缺点在于不能用于体内实验。

随着基因技术、生化技术的飞速发展, 目前商品化的基因重组酶包括CYPs、UGTs、FMOs 以及SULTs等。

重组酶在亚型鉴定中最突出的优势是能够直观考察受试化合物在单一同工酶中的所有代谢信息,包括代谢通路、代谢产物、代谢强度 (联合化学抑制剂) 以及代谢贡献率 (联合亚细胞成分) 等。

由于重组酶系统的组成单一且活性远高于体内正常水平, 其结果不能外推至体内, 甚至因其缺乏细胞内辅助因子而不适于外推至亚细胞成分。

Chen 等和Crewe等通过建立换算因子, 将基因重组酶实验获得的内在清除率 (CLint= Vmax/) 结合各亚型在人肝微粒体中相对丰度粗略估计各CYPs 同工酶在CYPs 代谢总清除中的贡献。

因此, 基因重组酶被认为是与体内一致性最差的亚型鉴定方法, 而相关性分析在体外代谢酶亚型鉴定中常用于辅证抑制剂实验或重组酶实验。

目前, 除以肝脏为基础的研究模型外, 体外代谢研究模型还延伸至心脏、肾脏、肠等器官, 这些器官中代谢酶的研究对一些靶向药物以及内源性物质的代谢具有重要意义。

譬如, Zordoky 等发现阿霉素诱导的急性毒性模型大鼠心脏中CYP ω-氧化酶(CYP4A1、CYP4A3、CYP4F1 及CYP4F4) 表达水平上调, 导致具有心脏毒性的20-羟基二十烷四烯酸(HETE) 合成显著增加, 同时环氧化物水解酶又降低心血管保护因子表氧化二十碳三烯酸 (EET) 的水平,加重心脏损伤。

2012 年, Anwar-Mohamed 等在急性砷毒性模型小鼠的心脏中观察到类似现象。

因此,针对某些特定适应证的新药开发, 除进行常规的代谢酶亚型鉴定外, 还应重视这些非典型代谢酶的亚型鉴定。

4代谢性相互作用

代谢性相互作用是指两种或两种以上的化合物在同时或前后序贯用药时, 在代谢环节产生作用的干扰, 导致疗效增强、产生毒副作用, 或疗效减弱、治疗失败。

随着代谢性疾病发病率的增加以及联合用药的普及, 药物相互作用的临床案例越来越多, 其中又以代谢性相互作用发生率最高 (约占药物相互作用的40%), 且90% 以上的代谢性相互作用是因CYPs 活性的改变引起的, 尤其是CYPs 的抑制作用(约占CYPs 代谢相互作用的70%)。

美国食品药品监督管理局 (FDA) 自1997 年以来颁布了药物代谢和药物相互作用研究的多个指南, 列举了一系列详细的体外/体内实验设计方案, 被代谢研究人员奉为“金标准”。

在新药早期评价中, 对代谢相互作用的研究主要借助荧光法、萤光法、放射法、N-in-one与LC-MS/MS 联用法以及速射 (rapidfire) 质谱等检测手段, 通过监测探针底物在各种体外模型(最常用的是人肝微粒体) 中的特征化代谢, 实现受试化合物群对多种药物代谢酶同工酶影响的高通量筛选。

随着技术的创新与理论的深入, FDA 的“金标准”不断得到修改与补充, 其中最受关注的是CYP2C9的相互作用研究, 因临床约15% 的治疗药物 (尤其是一些安全窗较窄的药物) 主要经CYP2C9 代谢。

首先,Williams 等与Hummel 等结合早Korzekwa等与Hutzler 等关于CYP2C9 异相激活的非典型酶动力学特征的报道, 进一步辅以核磁成像技术与分子对接技术证实CYP2C9 存在多个结合位点, 因此对其进行代谢相互作用研究应同CYP3A4 一样选用多个结构不相关的探针底物。

其次, CYP2C9 具有高度遗传多态性[http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c9.htm],绝大多数等位基因的突变 (eg. CYP2C9*2、*3、*5、*11、*13、*14、*16、*24、*26、*28、*30) 显著影响CYP2C9 的催化活性, 且这种突变的分布频率存在种族差异和地域差异。

Wiwanitkit 等提出了基因剂量效应, 即根据突变基因对代谢酶活性的影响划分为泛代谢型、中间代谢型以及弱代谢型3种表型。

除根据代谢表型差异调整临床用药方案外,Wiwanitkit 还建议对此类代谢酶进行代谢研究时应充分了解受试人群的代谢表型或合理选择受试表型,并注意研究结果的个体差异性与底物依赖性。

Hutzler等和Zhou 等在药物相互作用研究中也发现CYP2C9 的抑制效应存在底物依赖性。

除CYP2C9 外,近年来研究发现CYP2C8、CYP2C19、CYP2D6亦具有底物依赖性。

因此, 在药物相互作用的体外代谢评价中, 尤其是CYP2 与CYP3, 应尽可能选择两种或两种以上结构不相关的探针底物表征代谢酶活性, 以提高体外结果的可靠性和体内预测的准确性。

近年来与UGTs 相关的药物相互作用也越发受到关注, 尤其是中药提取物、中药单体以及代谢综合征的临床用药。

如格列美脲能够非竞争性抑制肝脏中UGT1A6 的活性; 调节系统免疫的中药单体淫羊藿苷及其肠道代谢产物对肠道多种UGTs 同工酶存在抑制效应; 白藜芦醇可在Caco-2 细胞中上调UGT1A1 水平, 且与多酚类物质如姜黄素等合用时诱导效应更加显著。

某些中药对代谢酶的调控还与时程相关, 如本实验室前期研究发现大鼠短期给予五味子木质素类可抑制CYP3A 的功能活性, 而长期给药则诱导其表达调控。

此外, 某些化合物在体内对I 相与II 相酶系具有双重干预效应, 故产生的净效应因药而异。

如药物诱导I 相代谢酶表达而使体内毒性中间产物增加, 同时诱导II 相代谢酶表达来增强此毒性代谢产物的进一步转化和排泄, 其净效应取决于临床终点或替代终点的实测情况。

5讨论与展望

自上世纪以来, 我国新药研究经历了仿创结合到以创新为主的过渡。

由于原创性新药的成功率较低且耗时过长, 目前国内创新药物仍以“Me too”或“Me better”为主。

此外, 我国中药资源丰富, 许多中药大品种如桂枝茯苓胶囊、复方丹参滴丸以及血脂康胶囊等均已获得美国FDA 新药临床研究的许可。

但与化学药物相比, 中药因多组分、多配伍、多靶点及体内外相关性差等特点导致其药代动力学研究远滞后于药效研究。

目前许多中药的体内药效物质谱与生物转化谱仍是空白, 成为中药在FDA 审评之路上的最大障碍。

近年来网络药理学、代谢组学等的发展为中药的代谢评价提供了新的契机。

本文通过对目前新药早期评价中被日本、美国、欧盟等广泛应用的几种具有突出指导意义的体外代谢评价模型(体外代谢稳定性, 体外代谢酶亚型鉴定, 体外代谢相互作用等) 的应用与发展进行归纳总结, 为建立符合中国国情的早期代谢评价模式提供参考 (图1)。

图1.jpeg

图1 创新药物早期代谢评价模式


来源:药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 1071−1079

外代谢在新药早期评价中的应用与发展
Application and development of in vitro metabolism study at early drug discovery stage

作者

吴 慧, 彭 英, 孙建国张雪媛, 仲云熙, 王广基
中国药科大学药物代谢动力学重点实验室

摘要
药物代谢研究与新药研发中的诸多环节密不可分, 包括候选化合物的设计与先导化合物的筛选等。

药物代谢研究一般分为体内代谢研究与体外代谢研究。

与体内代谢研究相比, 体外代谢研究可直接观察候选化合物与受试靶点的选择性作用, 不需要消耗大量的样品和实验动物, 操作快速简便, 适用于代谢信息不明确的候选化合物进行高通量筛选。

目前, 体外代谢研究已被广泛应用于新药的早期代谢评价中, 主要涉及代谢稳定性、代谢酶亚型鉴定以及代谢性相互作用等。

本文就体外代谢研究在上述三方面的具体应用进行归纳总结, 为中国创新药物实施“早期评价、早期淘汰”的研究策略提供参考。

正文
新药开发是一项耗资大、周期长、风险高的系统工程。

十余年来, 新化学实体 (NCEs) 转化成临床有效新药的速率不断下降, 一般来说, 上市一种新药的研发周期约为10~15 年, 耗资约3.5~5 亿美金,淘汰率在1/5 000 左右。

其中, 由安全性问题与药代动力学性质不良引起NCEs 成药失败的比例高达60%,且这一比例还在逐年升高。
2011年, 陈凯先院士在中国药学大会上对中国创新药物开发提出了“早期评价、早期淘汰”的研发策略。

新药开发过程通常包括临床前研究、临床试验、报批和生产上市4 个阶段。

药物代谢研究在新药开发的前两个阶段具有重要的指导意义, 尤其是在代谢信息不明确的开发早期。

通过利用各种体外代谢模型对候选化合物的代谢特性 (如代谢稳定性、代谢多态性、活性/毒性代谢产物生成、参与代谢的药物代谢酶种类以及代谢相互作用等) 进行高通量筛选, 可以对代谢过快或生成毒性代谢物的候选化合物进行结构改良, 或通过合成活性代谢物或模拟活性代谢物的结构得到新的候选化合物。

与体内代谢研究相比,体外代谢研究可在新药研发早期利用候选化合物的体外代谢参数合理预测候选化合物的体内药动学行为, 指导后期药效、药动以及安全性评价的模型选择,缩小体内研究的筛选范围。

近年来, 随着高分辨分析技术与分子生物学技术的发展, 以肝脏为基础的一系列体外代谢研究模型被广泛应用于新药研发的早期评价中。

本文就体外代谢研究在3 种早期评价策略 (代谢稳定性、代谢酶亚型鉴定、代谢相互作用) 中的具体应用与改进、取得的经验与成果以及目前存在的问题与争论作阐述,为建立符合中国国情的早期代谢评价模式提供参考。


1体外孵育系统

药物体外代谢研究与体内代谢研究相比, 可排除体内诸多干扰因素而直接观察药物代谢酶对底物的选择性代谢, 适用于体内代谢转化率低及缺乏灵敏检测手段的药物, 且省时省力、稳定高效, 尤适于大量化合物的高通量筛选。

目前,研究药物代谢的体外模型主要有亚细胞系模型(如微粒体、Cytosol、S9)、细胞系模型(如原代肝细胞、转基因细胞系、干细胞诱导分化的肝细胞)、重组酶系模型、组织切片模型及离体动物模型(如肝/肠灌流模型) 等,各模型在系统结构与代谢机制等方面各具特点 (表1)。
表1.jpeg

在长期的实践中, 研究人员除根据自身的研究背景、目的及条件选择恰当的体外模型进行代谢研究外,还对体外实验中的各成分 (如金属离子、孔道蛋白、有机溶剂、不饱和脂肪酸等) 和组成比例不断优化与改进, 以期对药物代谢情况做出合理准确的预测。

1.金属离子

1992 年, Yang发现生物系统中的二价金属离子 (如Mg2+) 可通过改变膜脂的物理状态间接影响膜结合蛋白 (如CYPs、UGTs 等) 的活性,而Fisher 等证实在体外人肝微粒体孵育系统中引入Mg2+可将UGTs 的反应速率提高4~7 倍。

因此MgCL2是体外孵育体系中的常见组分, 其常用浓度为5mmol·L−1或10mmol·L−1 。

2.孔道蛋白

葡糖醛酸转移酶 (UGTs) 是最重要的II 相代谢酶之一, 它与CYPs 均为膜结合蛋白, 共存于内质网膜上。

UGTs 的活性部位朝向内质网腔,导致体外孵育时UGTs 的活性表现需要溶解微粒体膜 (如Tritonx-100) 或者孔道蛋白 (如丙甲菌素) 的参与。

其中, Tritonx-100 等去污剂因多为非离子表面活性剂而对多种检测手段存在信号干扰, 故目前在微粒体孵育系统中通常使用丙甲菌素来提UGTs的活性。

丙甲菌素是一种膜活性肽, 能自发插入到脂双层中并相互聚集形成通道结构。

Fisher 等考察了微粒体孵育系统中丙甲菌素的浓度与膜结合蛋白酶的潜伏活性之间的关系, 发现丙甲菌素最佳浓度50μg·mg−1pro 时II 相结合反应速率提高了2~3 倍,但Walsky 等的最新报道中却认为在蛋白浓度较低时, 丙甲菌素浓度400 μg·mg−1pro 更为合适。

另有研究发现, 丙甲菌素对UGTs 的影响具有性别差异与种属差异。

Mazur以双酚A 在大鼠与人肝/肠微粒体中的葡糖醛酸结合反应为例, 对照组中双酚A 在雌鼠微粒体中Km 值远高于雄鼠, 在人肠微粒体中的Vmax略低于大鼠; 当丙甲菌素存在时, 双酚A 在大鼠微粒体中Km 值显著提高, 且雄鼠的增长幅度较雌鼠更大, 逆转了对照组中的雌雄差异, 同时双酚A 在大鼠和人肠微粒体中的Vmax也显著提高, 但大鼠的增长幅度较大 (约为人的30 倍)。

3.有机溶剂

研究表明, 常用有机溶剂 (甲醇、乙腈、DMSO、乙醇及异丙醇等) 均可影响多种CYPs同工酶介导的代谢反应, 其中DMSO 是公认的对代谢酶活性抑制最强的有机溶剂。

Li与Nirogi等分别报道极低含量的DMSO (0.1%) 即可使CYP1A2介导的非那西丁脱乙基代谢与CYP2E1 介导的氯唑沙宗6 位羟化代谢的反应量分别降至对照组的70% 与40%。

Vuppugalla 等发现CYP2B6 介导的安非他酮羟化代谢的动力学参数Km与体系中乙腈、DMSO、乙醇等有机溶剂呈浓度依赖性增大, 而CYP2C8 介导的紫杉醇羟化代谢的动力学参数Km仅与DMSO、乙醇呈浓度依赖性增大; 虽然甲醇对前者基本无影响,但对后者却存在低浓度降低其Km值、高浓度 (≥2%)增大其Km值的现象。

甲醇的这种双重效应在González-Pérez等的研究中再度被证实, 低浓度甲醇或乙腈(0~2%) 可降低CYP2C9 介导的 (S)-华法林羟化代谢的Km值, 而高浓度甲醇 (≥2%) 则增大其Km值;但含量2% 以下的乙腈、甲醇、乙醇对CYP3A4 介导的咪达唑仑1'-羟化代谢无显著影响。

因此Li 等建议在体外孵育系统中有机溶剂的含量应控制在1%及以下; 同时Kim等提出根据每个CYPs 亚型受每种有机溶剂影响程度的不同, 在高通量筛选中对混合探针底物进行合理的组合搭配以获得最佳孵育条件。

4.不饱和脂肪酸

近年来, 牛血清白蛋白 (BSA)效应在校正体外酶动力学参数方面的研究成为热门。

大量文献报道证实, 用BSA 矫正后的体外表观Km值进行体外−体内相关性分析所得到的体内肝清除率更接近于药物实测值 (2~5 倍)。

Rowland 等发现生物膜在体外孵育 (37 ℃) 过程中会释放一些抑制CYPs与UGTs活性的长链不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、花生四烯酸等), 而BSA 的加入可以封闭这些不饱和脂肪酸在孵育过程中自生物膜的脱落, 逆转Km值的升高, 称为“BSA 效应”。

如在BSA 存在下, 苯妥英羟化代谢的Kmu(unbound Km)显著降低 (约为对照组的5%) 而Vmax不变; 但后续研究发现, 高浓度BSA (~4%) 会使苯妥英的游离药物分数显著降低, 导致苯妥英羟化代谢的表观Km在BSA 存在下的变化不明确。

因此, BSA 亦是一把“双刃剑”, 其净效应取决于受试化合物与代谢酶的亲和力、代谢酶对受试化合物的代谢能力及受试化合物自身的蛋白结合率。

目前在体外孵育液中BSA的浓度通常控制在2% (w/v) 及以下, 常用浓度为0.5%、1%、2%。

过去认为BSA 在矫正酶动力学参数时一般仅降低Km值而不影响Vmax值, 但2011 年Manevski 等研究发现, 当选用专一性更强的探针底物恩他卡朋与齐多夫定代替常用的4-甲基伞形酮与丙泊酚来考察UGT1A9 与UGT2B7 时, BSA 降低两者的Km值,同时大幅提高UGT1A9 的Vmax值而不影响UGT2B7的Vmax值。

Manevski 在文中呼吁研究“BSA 效应”时应注意探针底物选择的多样性与合理性, 外推实验结果时需谨慎。

此外, 由于不饱和脂肪酸的抑制效应存在酶选择性, 故“BSA 效应”也存在酶选择性,如BSA 可降低UGT1A9 的Km值而对UGT1A1 与UGT1A6 无影响。

不仅是UGTs, 在本实验室开展的代谢研究中发现CYPs 也存在“BSA 效应”的底物选择性和酶选择性。

迄今为止, 确证存在“BSA 效应”的代谢酶主要有UGT1A9、UGT2B4、UGT2B7, 以及近几年刚被发现并纳入的CYPs同工酶 (CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9等)。

2体外代谢稳定性与体内外推

对候选化合物代谢稳定性的评估是早期药物研发的关键。

代谢稳定性差意味着化合物在体内较容易被代谢, 往往导致不良的药代动力学性质, 如体内生物利用度低、作用时间短等。

因此, 研究人员通常结合药效活性, 筛选出t1/2适宜、清除率低的化合物进行后续实验。

目前, 人肝微粒体已普遍应用于早期代谢稳定性的高通量筛选, 而人原代肝细胞或冷冻肝细胞主要应用于先导化合物的体外−体内参数外推(IVIVE)。

2009 年, Chao 等提出一种微流控细胞培养仿真系统, 它将生物芯片上载有不同细胞系的各个元件通过微流技术彼此关联形成一个信息网络,以模拟受试化合物在多个组织器官中的代谢清除。

在新药设计阶段, 由于代谢信息缺乏或不明确,通常采用底物消除法。选择较低浓度的酶蛋白 (≤ 1mg·mL−1) 与候选化合物 (≤ 10μmol·L−1)进行体外孵育, 以0 min 孵育液中的原药量 [S]0 作为100%,参照求算x min 孵育液中剩余原药 [S] 的相对百分数(R, %)。

其中, 在新药设计初期, 为满足大量候选化合物的高通量筛选, 通常固定一个反应时间 (如30 min),用此单点R值 (%) 区分快代谢化合物与慢代谢化合物, 以寻找目标化合物群。

随后, 在新药设计中期,针对目标化合物群, 选取5 或6 个孵育时间点 (一般在0~60 min 之间取点)的R值 (%) 对孵育时间作底物衰减的曲线图 (公式1) 或半对数图 (公式2), 根据公式3 换算, 或用SigmaPlot、WinNonlin、DeltaGraph等软件进行最小二乘法非线性拟合, 均可得到目标化合物群的体外消除速率常数 (ke) 与消除半衰期(t1/2, in vitro), 根据生理参数可进一步预测其体内清除率, 以寻找先导化合物群。

若此实验中同时考察多个底物浓度, 则可得到每个底物浓度水平下的ke值, 将其对底物浓度作曲线图 (公式4) 或倒数图 (公式5),通过软件拟合即可获得先导化合物群的酶动力学参数Km和Vmax值, 根据公式6 可得出代谢酶系统对NCEs 的内在固有清除率 (CLint, in vitro)。

辉瑞公司的Zhao 等提出了更为快捷的双点法与等比混合法, 通过公式7 可将获得的t1/2, in vitro直接转化为CLint, in vitro。

[S] = [S]0·e−ke·t(1)

lnR = −ke·t (令R = [S]/[S]0) (2)

t1/2= −ln(0.5)/ke= 0.693/ke(3)

ke= ke([S]→0)·(1−[S]/([S]+Km))

= Vmax/Km*(1−[S]/([S]+Km)) (4)

1/ke= 1/Vmax·[S]+Km/Vmax(5)

CLint, in vitro= Vmax/Km (6)

CLint, in vitro= 0.693/t1/2(7)

运用Houston和Carlile 等提出的比放策略,选择合适的肝脏生理模型 (静脉均衡模型、并联小管模型、分布和分散模型等), 通过生理转化因子可从体外CLint推导体内肝清除率 (CLh), 结合非肝消除途径即可得出总清除率。

2011 年, Zhu 等指出当受试化合物的固有清除率较低时, 3 种肝脏生理模型的体内预测结果相差不大; 但当固有清除率较高时(肝提取率 > 0.7), 3 种模型给出的肝清除率预测值差异较大; 相比而言, 运用较复杂的散射模型预测准确性较好。

然而, 在许多报道的回顾性研究中发现应用人肝微粒体进行IVIVE 总倾向于低估CL 值。

近年来, 为了提高IVIVE 的准确性, 研究人员针对预测的各个环节开展了大量研究, 包括血浆游离药物分数的校正以及在此基础上增加的微粒体温孵体系中游离药物分数的矫正, 应用人肝细胞替代人肝微粒体以弥补微粒体中缺失酶系对NCEs 的代谢清除, 选用经验因子或回归因子替代生理因子进行放大预测等。

虽然在一定程度上提高了IVIVE的可靠性, 但低估现象依然存在且机制不明。

一些研究人员认为在正常机体内环境中, 化合物经肝门静脉进入肝脏后, 须进入肝细胞才能发生代谢清除, 而绝大多数化合物以主动转运的方式进入肝细胞, 所以应将转运体的考察纳入IVIVE 对CL 的预测中。

不过目前尚未有足够的信息确证肝细胞的主动吸收机制对肝脏固有清除率的贡献。

3代谢酶亚型鉴定

在新药开发早期进行代谢酶亚型鉴定对预测潜在药物相互作用具有重要意义。

药物在体内的生物转化主要分为Ⅰ相代谢与Ⅱ相代谢, 其中CYPs 介导了大多数药物 (约75%) 的代谢, 在药物代谢中占据了非常重要的地位, UGTs 次之。

此外, 参与药物代谢的Ⅰ相反应酶系还包括黄素单氧化酶 (FMO)、单胺氧化酶 (MAO)、酯酶、黄嘌呤氧化酶、醇脱氢酶和醛脱氢酶等, Ⅱ相反应酶系还包括磺基转移酶 (SULT)和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 等。

代谢酶亚型鉴定的体外方法包括特异性化学抑制剂、单克隆抗体、基因重组酶、亚细胞成分 (需与化学抑制剂或单克隆抗体联合) 以及相关性分析等。

其中化学抑制剂的普适性最强但专一性差。如尼氟酸低浓度时是UGT1A9 的选择性抑制剂, 而高浓度 (≥50 μmol·L−1) 时对其他UGTs 同工酶也有抑制作用, 尤其是UGT1A1。

相比而言, 机制性抑制剂的作用专一性优于可逆抑制剂, 如CYP3A4 的机制性抑制剂CYP3cide可区分CYP3A4 和CYP3A5 这两种亚型。

单克隆抗体被认为是目前最有效的代谢酶亚型鉴定方法, 其优势在于高效、特异性强, 缺点在于不能用于体内实验。

随着基因技术、生化技术的飞速发展, 目前商品化的基因重组酶包括CYPs、UGTs、FMOs 以及SULTs等。

重组酶在亚型鉴定中最突出的优势是能够直观考察受试化合物在单一同工酶中的所有代谢信息,包括代谢通路、代谢产物、代谢强度 (联合化学抑制剂) 以及代谢贡献率 (联合亚细胞成分) 等。

由于重组酶系统的组成单一且活性远高于体内正常水平, 其结果不能外推至体内, 甚至因其缺乏细胞内辅助因子而不适于外推至亚细胞成分。

Chen 等和Crewe等通过建立换算因子, 将基因重组酶实验获得的内在清除率 (CLint= Vmax/) 结合各亚型在人肝微粒体中相对丰度粗略估计各CYPs 同工酶在CYPs 代谢总清除中的贡献。

因此, 基因重组酶被认为是与体内一致性最差的亚型鉴定方法, 而相关性分析在体外代谢酶亚型鉴定中常用于辅证抑制剂实验或重组酶实验。

目前, 除以肝脏为基础的研究模型外, 体外代谢研究模型还延伸至心脏、肾脏、肠等器官, 这些器官中代谢酶的研究对一些靶向药物以及内源性物质的代谢具有重要意义。

譬如, Zordoky 等发现阿霉素诱导的急性毒性模型大鼠心脏中CYP ω-氧化酶(CYP4A1、CYP4A3、CYP4F1 及CYP4F4) 表达水平上调, 导致具有心脏毒性的20-羟基二十烷四烯酸(HETE) 合成显著增加, 同时环氧化物水解酶又降低心血管保护因子表氧化二十碳三烯酸 (EET) 的水平,加重心脏损伤。

2012 年, Anwar-Mohamed 等在急性砷毒性模型小鼠的心脏中观察到类似现象。

因此,针对某些特定适应证的新药开发, 除进行常规的代谢酶亚型鉴定外, 还应重视这些非典型代谢酶的亚型鉴定。

4代谢性相互作用

代谢性相互作用是指两种或两种以上的化合物在同时或前后序贯用药时, 在代谢环节产生作用的干扰, 导致疗效增强、产生毒副作用, 或疗效减弱、治疗失败。

随着代谢性疾病发病率的增加以及联合用药的普及, 药物相互作用的临床案例越来越多, 其中又以代谢性相互作用发生率最高 (约占药物相互作用的40%), 且90% 以上的代谢性相互作用是因CYPs 活性的改变引起的, 尤其是CYPs 的抑制作用(约占CYPs 代谢相互作用的70%)。

美国食品药品监督管理局 (FDA) 自1997 年以来颁布了药物代谢和药物相互作用研究的多个指南, 列举了一系列详细的体外/体内实验设计方案, 被代谢研究人员奉为“金标准”。

在新药早期评价中, 对代谢相互作用的研究主要借助荧光法、萤光法、放射法、N-in-one与LC-MS/MS 联用法以及速射 (rapidfire) 质谱等检测手段, 通过监测探针底物在各种体外模型(最常用的是人肝微粒体) 中的特征化代谢, 实现受试化合物群对多种药物代谢酶同工酶影响的高通量筛选。

随着技术的创新与理论的深入, FDA 的“金标准”不断得到修改与补充, 其中最受关注的是CYP2C9的相互作用研究, 因临床约15% 的治疗药物 (尤其是一些安全窗较窄的药物) 主要经CYP2C9 代谢。

首先,Williams 等与Hummel 等结合早Korzekwa等与Hutzler 等关于CYP2C9 异相激活的非典型酶动力学特征的报道, 进一步辅以核磁成像技术与分子对接技术证实CYP2C9 存在多个结合位点, 因此对其进行代谢相互作用研究应同CYP3A4 一样选用多个结构不相关的探针底物。

其次, CYP2C9 具有高度遗传多态性[http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c9.htm],绝大多数等位基因的突变 (eg. CYP2C9*2、*3、*5、*11、*13、*14、*16、*24、*26、*28、*30) 显著影响CYP2C9 的催化活性, 且这种突变的分布频率存在种族差异和地域差异。

Wiwanitkit 等提出了基因剂量效应, 即根据突变基因对代谢酶活性的影响划分为泛代谢型、中间代谢型以及弱代谢型3种表型。

除根据代谢表型差异调整临床用药方案外,Wiwanitkit 还建议对此类代谢酶进行代谢研究时应充分了解受试人群的代谢表型或合理选择受试表型,并注意研究结果的个体差异性与底物依赖性。

Hutzler等和Zhou 等在药物相互作用研究中也发现CYP2C9 的抑制效应存在底物依赖性。

除CYP2C9 外,近年来研究发现CYP2C8、CYP2C19、CYP2D6亦具有底物依赖性。

因此, 在药物相互作用的体外代谢评价中, 尤其是CYP2 与CYP3, 应尽可能选择两种或两种以上结构不相关的探针底物表征代谢酶活性, 以提高体外结果的可靠性和体内预测的准确性。

近年来与UGTs 相关的药物相互作用也越发受到关注, 尤其是中药提取物、中药单体以及代谢综合征的临床用药。

如格列美脲能够非竞争性抑制肝脏中UGT1A6 的活性; 调节系统免疫的中药单体淫羊藿苷及其肠道代谢产物对肠道多种UGTs 同工酶存在抑制效应; 白藜芦醇可在Caco-2 细胞中上调UGT1A1 水平, 且与多酚类物质如姜黄素等合用时诱导效应更加显著。

某些中药对代谢酶的调控还与时程相关, 如本实验室前期研究发现大鼠短期给予五味子木质素类可抑制CYP3A 的功能活性, 而长期给药则诱导其表达调控。

此外, 某些化合物在体内对I 相与II 相酶系具有双重干预效应, 故产生的净效应因药而异。

如药物诱导I 相代谢酶表达而使体内毒性中间产物增加, 同时诱导II 相代谢酶表达来增强此毒性代谢产物的进一步转化和排泄, 其净效应取决于临床终点或替代终点的实测情况。

5讨论与展望

自上世纪以来, 我国新药研究经历了仿创结合到以创新为主的过渡。

由于原创性新药的成功率较低且耗时过长, 目前国内创新药物仍以“Me too”或“Me better”为主。

此外, 我国中药资源丰富, 许多中药大品种如桂枝茯苓胶囊、复方丹参滴丸以及血脂康胶囊等均已获得美国FDA 新药临床研究的许可。

但与化学药物相比, 中药因多组分、多配伍、多靶点及体内外相关性差等特点导致其药代动力学研究远滞后于药效研究。

目前许多中药的体内药效物质谱与生物转化谱仍是空白, 成为中药在FDA 审评之路上的最大障碍。

近年来网络药理学、代谢组学等的发展为中药的代谢评价提供了新的契机。

本文通过对目前新药早期评价中被日本、美国、欧盟等广泛应用的几种具有突出指导意义的体外代谢评价模型(体外代谢稳定性, 体外代谢酶亚型鉴定, 体外代谢相互作用等) 的应用与发展进行归纳总结, 为建立符合中国国情的早期代谢评价模式提供参考 (图1)。

图1.jpeg

图1 创新药物早期代谢评价模式


来源:药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 1071−1079

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